期刊：ClinicalInfectiousDiseases
影响因子：9.
近日，派森诺生物与华中农业大学动科动医学院陈焕春院士团队王湘如老师合作，在传染病领域国际权威期刊ClinicalInfectiousDiseases在线发表了题为“Anovelhumanacuteencephalitiscausedbypseudorabiesvirusvariantstrain”的研究论文。
研究背景
伪狂犬病*(Pseudorabiesvirus,PRV)属于疱疹病*(Alphaherpesvirinae)，宿主广泛，猪是其天然宿主。被PRV感染的母猪表现出生殖衰竭，新生猪表现出致命性脑炎，死亡率％，生长肥育的猪表现出呼吸窘迫和生长障碍，其他易感动物也通常以死亡告终。自年以来，根据临床症状，动物接触史或检测到的抗体，偶有争议的人类PRV感染病例。年以来，基于患者组织样本的二代测序结果，中国又陆续报道了13例临床诊断为人感染PRV的病例，但在上述所有病例报道中，均未成功分离出PRV。
在本研究中，报道了4例由伪狂犬病病*（PRV）感染引起的人急性脑炎病例，总结了PRV感染人的临床特征，并首次从患者脑脊液中分离得到一株PRVhSD-1/。此外，本研究还对该PRV分离株hSD-1/进行了病因学和遗传特征研究，该*株的生物学特性表现与当前我国猪群中流行的PRV变异*株相似。该研究首次为PRV向人群的跨种传播提供了直接有力的病*分离证据。
研究材料和方法
临床病例调查
获得4例患者的血液、血清和脑脊液标本，用于常规临床和实验室诊断。
病*分离和病原学鉴定
采集患者脑脊液进行病*分离。通过PCR扩增PRV的gB和gE基因，透射电镜(TEM)和间接免疫荧光检测(IFA)确认病*的存在。
从感染细胞裂解液中提取hSD-1/和HuBXY/的基因组DNA，并利用二代BGI平台和三代PacBio平台进行测序，由上海派森诺生物科技有限公司完成。收集NCBI中所有具有基因组序列的PRV菌株作为参考，基于基因组的完整编码序列(CDS)区域和gC基因分别构建系统发育树。
进行中和试验以检查PRV*株的免疫原性。测定PRV菌株的斑块大小，并在MDBK细胞中进行比较。
研究hSD-1/和HuBXY/在小鼠和猪体内的致病性。记录每日直肠温度和临床体征，并使用gE特异性TaqManqPCR检测组织中的病*。
伦理知情同意和参与
患者的所有治医院伦理委员会授权。
统计分析
数据以三种独立检测方法的均值±标准误差(mean±SEM)表示。使用GraphPadPrism(version6.0,LaJolla,CA,USA)进行统计分析。
研究结果
4例人类急性脑炎诊断为PRV感染
在本研究中，研究团队总结了4例人类急性脑炎病例的流行病学和临床特征。这4名患者的接触史显示，人类主要通过血液或粘膜接触受感染的猪或受污染的物质，具有显著的感染风险。患者在疑似伤口暴露后的7天内出现“流感样”的症状，病程发展较快，从最初的发烧发展为神经系统症状（如癫痫发作）仅需1-5天。与病例1和病例4相比，合并呼吸衰竭的病例2和病例3出现更严重的肺炎，表现为多灶性散乱空域混浊、支气管周围实变为主区域和胸腔积液。
MRI显示4例脑炎患者具有相似的脑部病变累及区域，其中病例1和病例3的视网膜MRI结果显示分层效应，提示视网膜脱离。与那些易感动物而不是猪的确切死亡结果不同，人类在感染后接受足够的抗病*治疗可以存活，但一些患者会出现严重的神经后遗症。
为了进一步揭示PRV感染人的病例特征，研究人员以病例1为代表，通过动态监测病*gB拷贝数和PRV特异性抗体，展示其病因学和血清学变化。研究结果发现gB抗体的血清转化时间明显早于gE抗体，且在转化后均持续保持阳性；血清中和抗体出现了超过4倍的滴度变化。ddPCR的结果显示，在不同的取样日期，在血液、脑脊液和咽喉拭子中均检测到病*DNA，在第8天到第15天在血液中检测到高水平的病*DNA，这与白细胞减少的持续时间相符，在第8天进行抗病*治疗，有效地减少了血液中的病*拷贝。值得注意的是，在晚期咽喉拭子中经常检测到大量的gB拷贝，提示咽喉可能是人类PRV复制和脱落的靶器官。
从患者中成功分离出PRVhSD-1/
研究人员首次成功从患者的脑脊液样品中分离得到PRV*株hSD-1/，并对其进行了电镜观察、免疫荧光分析以及全基因组测序分析。
系统发育分析
将组装好的hSD-1/和HuBXY/(GenBank登录号分别为MT和MT)基因组DNA进行系统发育分析。基于全基因组和gC基因的系统发育分析均表明该hSD-1/*株属于基因II型，来自中国的PRV分离株位于一个单独的系统发育分支上，与其他国家的分离株不同。在该分支中，hSD-1/与PRV变异株HNX和HN相邻，而与Fa、Ea和SC等经典菌株亲缘关系较远。
免疫原性分析
研究团队进行交叉中和试验以确定hSD-1/的免疫原性。结果显hSD-1/与PRV变异株具有相似的免疫原性，但与经典*株Ea不同。该研究测试了4名患者血清对hSD-1/和Ea的中和能力，所有患者的血清对hSD-1/的中和效价均高于对Ea的中和效价，进一步支持了从免疫原性角度看，hSD-1/菌株可能导致人类感染。
hSD-1/体外增殖特性研究
通过空斑实验、增殖曲线和CPE观察，评价hSD-1/在多个细胞系中的增殖特性，这些观察结果表明hSD-1/是PRV变异株，表现与PRV经典株不同。
hSD-1/的体内致病性
研究团队通过在小鼠中检测LD50来研究hSD-1/和其他PRV*株的致病性。考虑到患者的接触史，还在猪身上测试了其致病性。结果表明hSD-1/可感染小鼠和猪，并表现出较高的致病性。
讨论
该研究较为系统地跟踪研究并总结了人感染PRV导致急性脑炎的临床病例特征，根据人源PRV株hSD-1/的病原学特征和系统发育关系，首次分离并鉴定为中国变异株，为PRV的跨种感染研究提供了新的病原学证据和基础。这种“威胁生命的新的人畜共患病”值得更多