年11月发表在CLINICALCHEMISTRY（IF7.3）上的这篇文章中，FilkinsLM等通过对临床研究和病例报告的严格评估，总结了不同样本类型中mNGS检测病原的表现，对其具有最大临床影响的患者特征和临床病症，以及方法学优势和局限性进行了综述，并对mNGS的早期临床应用提出了建议。在此，我们对文中关于mNGS在脑脊液、血浆等各类样本中的检测表现，以及检测时需要考量的事项进行解读。
01
脑脊液mNGS应用
脑膜炎和脑炎的临床症状和体征通常会引发对潜在病原体的广泛检查，无法诊断和治疗这些感染会导致严重的发病率和死亡率。尽管通过培养、PCR和血清学方法进行了检测，但在许多情况下，致病病原体仍未被识别。致病微生物的广泛性和脑脊液正常的无菌环境使mNGS检测脑脊液优势显著。许多病例报告描述了mNGS检测到的非典型病原体，包括布鲁氏菌、钩端螺旋体、阿米巴原虫、星状病*、卡奇谷病*、日本脑炎病*、戊型肝炎病*等。脑脊液mNGS的临床实验室验证结果显示，与临床微生物学检测结果相比，总体上阳性符合率80%、阴性符合率95%，具有良好的性能。
临床研究数据
研究1：Wilson等人的一项前瞻性研究中，招募了名脑膜炎和脑炎患者，以评估临床mNGS检测在诊断检查中的作用。在感染病例中，有22%是mNGS检出而常规检测未检出的，且其中7个为治疗提供了指导；有45%是常规检测发现而mNGS未发现的，其中8个病原体滴度较低，18个是通过其它方法诊断的（血清学或非脑脊液样本）。在某些情况下，mNGS提供了病*基因分型、耐药基因分析和物种鉴定等信息。研究2：对20例患有不明原因脑炎患儿的mNGS研究发现，6例确定了未明病因，但同时还检测到了污染菌或非病原体。研究3：使用mNGS诊断了7名慢性脑膜炎患者，并强调了开发诸如评分算法等方法来处理对照样本中微生物的必要性。这些研究表明，与常规诊断检测相比，mNGS的诊断效率更高，且部分可对检出病原体指导治疗。在许多情况下，没有mNGS就很难诊断这些意想不到或非典型的病原体。局限性
仅mNGS检测不能排除感染，需要通过培养和血清学方法进行检测。污染物和非致病性共生微生物的检测仍然是一个问题，需要实验室处理和生信分析算法中的污染控制，以及合理的临床解释。在脑脊液mNGS检测的各个阶段需要考虑的事项如下：
02
血液mNGS应用
微生物及其核酸经常从全身器官转移到循环血液中，使血液成为诊断血液和非血液感染性疾病的合适样本。文中强调了来自血浆、血清或全血的mNGS最常见的临床病症，评估了其实用性、局限性，并概述了检测的需考量事项。
脓*症
可通过血培养鉴别病原体的脓*症病例不到20%，在一半以上的患者中，常规检测鉴定不出病原体。
研究1：SEP-SEQ临床试验招募了名有脓*症临床症状的患者，其中63例血培养阳性，59例mNGS鉴定出相同的微生物（灵敏度93.7%），且血浆mNGS鉴定出了15%常规检测未检出病例的可能病原体。研究2：在一项对越南例病因不明的社区获得性脓*症患者的多种样本类型的探索性mNGS研究中，93%的患者检测到多种病*，并通过PCR验证了32份血清中感染人类的病*，这些病*的存在与脓*症之间的直接临床联系仍不清楚。培养阴性心内膜炎
mNGS是一种有前景的用于培养阴性心内膜炎诊断的方法。
研究1：Kondo等报告了一名有人工瓣膜的29岁男性患者，通过血浆mNGS诊断出伯纳特氏立克次氏体心内膜炎，从而能够更早地进行针对性治疗。研究2：在一项由Hogan等人进行的多中心回顾性研究中，血浆mNGS在1/7疑似心内膜炎患者中确诊病原体，并指导治疗。总体而言，血浆mNGS在培养阴性的感染性心内膜炎中应用证据有限。相反，对切除的瓣膜组织进行16SrDNAPCR，然后进行Sanger测序或NGS的方法是经过充分研究的，可在高达98%的病例中检测到可能的感染病原。
社区获得性肺炎
在一项对15名社区获得性肺炎患儿的研究中，mNGS在87%病例中检测到细菌病原体，而传统方法的阳性率为27%。肺炎链球菌是mNGS捕获到的传统方法未检出的主要病原体，有效缩小了47%患者抗生素治疗范围，使这一群体成为由于mNGS检测而产生积极影响的高收益人群。然而，与mNGS的成本相比，减少抗生素治疗的益处可能不会得到许多机构的青睐。
侵袭性真菌和分枝杆菌病
真菌和分枝杆菌的传统检测存在生长缓慢、常需侵入性操作的局限性，这使得血浆mNGS有望成为替代方案。mNGS也可检测到弥散性或局限性分枝杆菌感染，但缺乏全面的临床评估。
研究1：Hong等人发现，在侵袭性真菌感染的成人组织活检中，与传统方法相比，mNGS的临床敏感度为86%。研究2：在一项针对40名有侵袭性真菌病风险的免疫受损患儿的研究中，mNGS发现了4/5的临床相关、经培养证实的真菌病例，包括非血源性感染。研究3：Hogan等人描述了7%患者血浆mNGS的积极临床影响，其中包括3例新的或更早的真菌诊断促成了更早的抗真菌治疗优化。研究4：Nomura等描述了一项针对心脏手术后患者的单点回顾性研究，血浆mNGS检测出90%经培养确认的分枝杆菌复合体感染。即使是在这些高危患者中，也建议首先进行分枝杆菌复合体的靶向检测，从心脏组织中提取16SrDNAPCR和测序可以在80%以上的患者中提供阳性检测。虽然血浆mNGS检测常规细菌的应用更为常见，但检测真菌和分枝杆菌的临床意义可能更大，因为通常是因*性而避免经验性抗分枝杆菌和抗真菌治疗，一旦检测到，就可以开始或升级治疗。相反，在接受多种抗菌药治疗的高危患者中，诊断可以缩小治疗范围。
居外患者或旅行者的发热性疾病
由于可能接触不同的病*、寄生虫、细菌和真菌，旅外和居外患者发烧常引起鉴别诊断。
研究1：对40例从英国出国旅游后12周内出现发热性疾病的成人患者进行了回顾性研究，血清或血浆mNGS确认了其中9例患者的临床诊断，并新增了另外3例诊断（2例基孔肯雅病*和1例流行性腮腺炎病*）。研究2：评估了来自坦桑尼亚的12名患有不明原因发热性疾病的成年患者，血浆mNGS检测出其病*感染。4例患者检测到登革病*，2例患者检测到HIV-1，2例患者检测到西尼罗病*，2例与临床相关性不明的humanpegivirus混合感染。研究3：在对肯尼亚名发烧成人的混合血浆的研究中，检测到多种病*，包括一种新出现的虫媒病*—Kadipiro病*。这项研究例证了mNGS在检测缺乏报道或新出现的病原体方面的潜在作用。然而，如果需要新出现的或新的病原体鉴定，所选的检测数据库和分析流程必须用于罕见微生物的检测。寄生虫感染
mNGS对血液中原生动物和蠕虫的检测主要是以研究为基础的。Vijayvargiya等人在对已知的田鼠巴贝虫、恶性疟原虫和Mansonellaperstans阳性患者样本进行mNGS检测时发现，具有完整的、已发表的基因组的微生物很容易识别，但不常见的M.pestrans却不容易识别。虽然大多数mNGS研究使用全血或血浆，但干血斑对检测一些寄生虫感染是有用的，例如用扩增子测序的疟原虫单倍型研究。
评估mNGS作为寄生虫检测的主要诊断方法的实用性还需要进一步的研究。
局限性
正如一项评估血浆mNGS的临床影响的多中心回顾性研究所证明的那样，当临床团队自行决定实施mNGS时，mNGS的结果很少影响护理（71/82例没有影响）。在该研究中，只有6例临床效果良好，3例临床效果不佳，2例效果不明显。mNGS的高成本、有限的积极临床影响和潜在的负面影响突出了这一方法的复杂性，并强调了在检测之前和解释结果时需要进行多学科讨论。
在血浆中经常检测到共生微生物，这些可能是真正的病原体，也可能是临床上无关紧要的。例如，在SEP-SEQ试验中，在62/名患者中检测到微生物DNA，但判定其不是脓*症的原因。为了避免过度诊断，已经提出了read数阈值，但反过来却降低了分析灵敏度。例如，对SEP-SEQ研究中报告的“明确”病例应用MPM的临界值，可排除31%的阳性结果和近一半的“可能”病例诊断。
用mNGS检测寄生虫面临着独特的挑战，包括罕见寄生虫缺乏完整的基因组序列，以及这些真核寄生虫含有与人类相似的细胞膜结构和基因同源性，限制了病原体富集方法的有效性，寄生虫可能会被用来裂解人类细胞和选择性去除CpG甲基化的试剂裂解。
最后，只有血浆或血液中的DNA靶向检测不能检测到RNA病*，除非有大量的前病*DNA。如果需要评估RNA病*，应该用靶向分子分析或血清学来代替mNGS或作为mNGS的补充。
在血液样本mNGS检测的各个阶段需要考虑的事项如下：
03
组织mNGS检测
扩增测序可用于新鲜或保存组织的临床检测，但mNGS仍然主要侧重于调查研究。
中枢神经系统感染
研究1：在对10名有神经炎症病程的患者的中枢神经系统组织的前瞻性研究中，组织mNGS在3例中确定了病原（结核分枝杆菌、JC多瘤病*和EB病*），且得到了其它方法的结果支持。研究2：Lipowski等人用mNGS在相同捐赠者的两个移植受者脑组织中检测到蜱传脑炎病*，随后通过靶向PCR在捐赠者的脑组织中检测到蜱传脑炎病*。在这些相关病例中，mNGS有助于检测意想不到的潜在病原体。限制
由于组织样本中宿主核酸量极高，病原体reads被检测到的数量非常少，与其它样本类型相比，可能需要更高的测序深度。福尔马林固定、石蜡包埋的组织是巨大的挑战，因为防腐剂会降解、破坏和断裂DNA，导致分析灵敏度降低。
精彩未完，下期再续！
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