导读
传染性脑炎和脑膜炎是严重的临床疾病，在世界范围内发病率和死亡率都很高。然而，由于可用于检测的脑脊液量比较少，同时血脑屏障导致病原体滞留在脑内等原因，使得在50%的急性脑炎/脑膜炎患者中无法鉴定到特异性的病原体。此外，病毒性脑炎和脑膜炎、结核性脑膜炎、细菌性脑膜炎和真菌性脑膜炎具有相似的临床表现和脑脊液表现，而传统检测方法无法同时鉴定多种微生物，检出率也比较低。
宏基因组测序作为一种创新的、有前景的微生物检测方法，可以同时、无偏倚地鉴定人体样本中的所有微生物。已有一部分研究利用mNGS诊断感染性中枢神经系统疾病，但多数样本量较小。同时由于微生物基因组大小和生活方式不同，对mNGS检测结果需要更详尽的分析。鉴于上述原因，医院(北京医院)第一医学中心神经内科张家堂主任团队联合多家单位，进行了一项大型前瞻性研究来评估mNGS在感染性脑炎和脑膜炎中的诊断效能。
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文献ID
英文题目：MetagenomicNext-GenerationSequencingforDiagnosisofInfectiousEncephalitisandMeningitis:ALarge,ProspectiveCaseSeriesofPatients
中文题目：宏基因组测序诊断传染性脑炎和脑膜炎：例患者的大型前瞻性研究
发表期刊：FrontiersinCellularandInfectionMicrobiology
见刊时间：年05月IF：4.
发表单位：医院(北京医院)第一医学中心神经内科张家堂主任团队等
材料与方法
该项前瞻性多中心研究在中国北京的6家医院进行，共计招募了名患者，最终纳入了例患者进行mNGS研究。纳入标准：临床高度怀疑为中枢神经系统感染性疾病的患者。排除标准：拒绝腰椎穿刺、此类穿刺的任何禁忌症以及自身免疫性脑炎的诊断。根据最终诊断将符合条件的患者分为五组：病毒性脑炎和/或脑膜炎、结核性脑膜炎（TBM）、细菌性脑膜炎、真菌性脑膜炎和非感染患者，所有患者均接受了至少3个月的随访。图1展示了患者的入组情况。
图1患者的入组情况
按照标准无菌程序采集脑脊液标本，快速冷冻，-20℃保存，24小时内进行mNGS检测，测序平台：BGISEQ-/50，测序数据量：20Mreads。获得的测序数据在去除人源序列后，与病原数据库进行比对。同时，与阴性对照相比，去除常见的背景微生物和在过去3个月内50%的样本中出现的微生物，最终得到疑似致病微生物的序列表。接下来，对序列表进行物种特异性读数(SSRN)、基因组覆盖率(%)和深度分析。通过参考文献鉴定可能的病原微生物，同时结合临床表现分析检测结果。主要遵循以下原则，当病原检测结果与临床表现相符时，mNGS结果再通过传统方法(血清学试验、涂片、培养和/或PCR)进行验证。另外，在非病毒感染的患者中，mNGS检测到单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒、爱泼斯坦巴尔病毒和巨细胞病毒被认为是假阳性；在非细菌性脑膜炎患者中，mNGS检测到肺炎链球菌、金*色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌和脑膜炎奈瑟菌被认为是假阳性；在没有CNS曲霉病的患者中，mNGS检测到烟曲霉、*曲霉、黑曲霉和土曲霉被认为是假阳性。
研究成果
1、病人特点
在6家医院接受治疗的例患者最终被纳入研究，包括75例病毒性脑炎和/或脑膜炎患者，44例结核性脑膜炎患者，43例细菌性脑膜炎患者，18例真菌性脑膜炎患者，33例非感染性中枢神经系统疾病患者（如图1所示）。所有感染性脑炎和/或脑膜炎患者均由单一研究者进行筛查，并最终确定诊断分型。大部分患者(/,83.57%)医院第一医疗中心接受治疗。非感染性中枢神经系统疾病包括脑膜癌(6/33,18%)、与结缔组织疾病相关的脑病(6/33,18.18%)、代谢性脑病(5/33,15.15%)和其他非感染性疾病(16/33,48.48%)。临床资料汇总见表1。
表1入组患者临床资料汇总
2、应用mNGS诊断病毒性脑炎和/或脑膜炎
纳入了75例病毒性脑炎和/或脑膜炎患者(54例确定，21例可能)。如果CSF样品的检测结果表现出SSRNs≥1、2、3、5或10，mNGS结果被认为是阳性的。当SSRNs≥1、2、3、5或10时，病毒性脑炎和/或脑膜炎阳性结果一致性分别为32、30.7、29.3、26.7和22.7%；阴性结果一致性分别为84.8、89.1、89.9、89.9和92.8%；总一致性分别为66.2、68.5、68.5、67.6和68.1%；AUCs分别为0.、0.、0.、0.和0.。当SSRN≥2作为阳性结果判定标准时，对应的AUC(0.)比其他SSRNs判定值对应的AUC要大。对于54例明确的病毒性脑炎和/或脑膜炎患者，如果SSRN≥2作为阳性结果判定标准，则AUC最大(0.，图2A)，阳性结果一致性、阴性结果一致性及总一致性分别为：42.6、89.1和76.0%(表2)。
图2mNGS及传统微生物检测方法的阳性检出率
表2不同mNGS阳性判断值的病毒性脑炎和/或脑膜炎诊断效率比较
3、应用mNGS诊断结核性脑膜炎（TBM）
纳入了44例TBM患者（明确6例，可能38例）。如果CSF样品的检测结果表现出属水平特异序列数≥1、2、3、5或10，mNGS结果被认为是阳性的。当属水平特异序列数≥1、2、3、5或10时，结核性脑膜炎阳性结果一致性分别为27.3、20.5、18.2、13.6和6.8%；阴性结果一致性分别为96.4、97.6、98.2、99.4和%；总一致性分别为82.2、81.7、81.7、81.2和80.8%；当属水平特异序列数≥1作为阳性结果判定标准时，对应的AUC(0.)最大。在6例明确TBM患者(包括5例XpertMTB/RIF阳性和1例神经组织抗酸染色阳性)中，mNGS的敏感性和特异性分别为66.67%(4/6)和96.45%(/)。在44例推定为TBM的患者中(确定6例，可能39例)，CSFXpertMTB/RIF阳性率为16.13%(5/31)，mNGS阳性率为27.27%(12/44)，mNGS和XpertMTB/RIF联合阳性率为29.55%(13/44)(图2B1)。不幸的是，所有CSF样本抗酸杆菌染色和结核分枝杆菌培养结果均为阴性。
4、应用mNGS诊断细菌性脑膜炎
纳入了43例细菌性脑膜炎患者(15例确诊，28例可能)。如果CSF样品的检测结果表现出SSRNs≥2、3、5、10或15，mNGS结果被认为是阳性的。当SSRNs≥2、3、5、10或15时，结核性脑膜炎阳性结果一致性分别为62.8、62.8、55.8、55.8和51.2%；阴性结果一致性分别为82.9、87.6、95.9、95.9和95.9%；总一致性分别为78.9、82.6、87.8、87.8和86.9%；AUCs分别为0.、0.、0.、0.和0.。当SSRNs≥5或10作为阳性结果判定标准时，对应的AUC(0.)最大。同时，在此判定标准下，mNGS对15例确诊细菌性脑膜炎的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为73.3、95.9、61.1和97.6%，曲线下面积（AUC）最大（0.）。总体来看，在43例假定为细菌性脑膜炎的患者中(15例确定，28例可能)，mNGS在24例（55.8%，24/43）中鉴定出细菌病原体；相反，脑脊液革兰氏染色/培养联合阳性率只有32.56%（14/43）。mNGS与传统检测两种方法联合应用，阳性率可提高至62.79%（27/43）(图2B2)。在24例mNGS结果阳性(SSRNs≥5或10)的患者中，前三位病原体分别为肺炎链球菌(41.7%，10/24)、肺炎克雷伯菌(12.5%，3/24)和单核增生李斯特菌(8.3%，2/24)。值得注意的是，在非细菌性脑膜炎患者中，mNGS有4.1%(7/)的假阳性结果，检测到金*色葡萄球菌(57.1%，4/7)、肺炎链球菌(28.6%，2/7)和流感嗜血杆菌(14.3%，1/7)。
5、应用mNGS诊断真菌性脑膜炎
在13例确诊的隐球菌性脑膜炎患者中，脑脊液印墨染色和真菌培养首次阳性率分别为0和38.4%。经多次染色/培养，两种方法的阳性率为84.62%。所有(12/12)脑脊液样本中均检出隐球菌抗原。当SSRN≥2作为阳性结果判定标准时，mNGS检测结果的敏感性为76.92%(10/13)，特异性为99.52%(1/)，阳性预测值为90.91%(10/11)，阴性预测值为98.56%(/)。在5例确诊的脑曲霉菌病患者中，当SSRN≥2作为阳性结果判定标准时，mNGS检测结果的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为80%(4/5)、79.3%(/)、8.5%(4/47)和99.40%(/)。
6、应用mNGS诊断四类中枢神经系统感染
在名有可能为4种脑炎和/或脑膜炎（病毒性脑炎和/或脑膜炎、TBM、细菌性脑膜炎、真菌性脑膜炎）患者中，mNGS的阳性检出率为40.6%(73/)(表3)；在93名明确为4种脑炎和/或脑膜炎患者中，mNGS的阳性检出率为57.0%(52/93)。
表34种中枢神经系统感染的mNGS阳性结果
研究结论
该研究评估了mNGS在感染性脑炎和脑膜炎中的诊断效能。结果显示，由于病原体基因组序列和生活方式的差异，不同类型的病原体当设定不同的阳性判断标准。其次，与传统方法相比，mNGS在检测中枢神经系统感染方面更为有效(图2B)。此外，将mNGS与传统微生物检测相结合，能够提高对中枢神经系统感染病原体的检出率。
对检测结果更详尽的分析发现：mNGS对病毒性脑炎和/或脑膜炎没有显著的预测作用(0.5AUC0.7)，可能部分原因是没有检测RNA。RNA病毒，如肠道病毒和日本脑炎病毒等，是病毒性脑炎和脑膜炎的常见病因。因此，必须改进DNA/RNA共提取方法，同时进行DNA和RNA测序，以提高病毒检出率。mNGS在TBM诊断方面具有很大的实用价值，虽然mNGS对TBM的诊断效用不高(0.)，但考虑到目前的诊断困境，mNGS无疑是非常有用的。值得注意的是，mNGS在结核性脑膜炎诊断中的特异性为96.4%，因此mNGS检测阴性可作为排除TBM的诊断方法之一。
此外，本研究发现肺炎链球菌是细菌性脑膜炎的主要致病病原体。并且结果显示，金*色葡萄球菌作为一种非常常见的病原体，如果存在于脑脊液中，可能导致假阳性结果。对于真菌性脑膜炎，该研究发现mNGS对隐球菌性脑膜炎的诊断价值低于传统方法(印墨染色、培养和隐球菌抗原检测)。可能原因是隐球菌的厚壁没有被充分破碎，DNA无法释放。因此，细胞壁破损技术还需要不断的优化与提升。尽管如此，脑脊液的mNGS检测还是可用于鉴别隐球菌的种类，从而改善隐球菌脑膜炎的诊断和治疗。虽然本研究中脑曲霉病的患者很少，但由于mNGS的非侵袭性，研究者推测mNGS可能成为未来脑曲霉病的一线诊断方法。
作为微生物检测的一种新方法，mNGS在识别传染性脑炎和脑膜炎的病原体方面比传统检测具有某些优势，这项新技术显示出巨大的潜力。但是，仍然需要注意DNA和RNA的共提取方法、提取效率、定植与感染的区别以及方法的标准化等问题，以使该技术更好地服务于临床。
亮点
本研究纳入了较大规模的脑炎和脑膜炎患者人群，并将符合条件的患者分成4种不同的中枢神经系统感染组（病毒、结核、细菌、真菌组）。同时，根据不同的感染类型，对mNGS检测结果进行详细地分析解读，评估了mNGS在脑炎和脑膜炎中的应用价值。
关于锐翌
上海锐翌生物科技有限公司成立于年，总部位于上海市浦江高科技园，已在杭州、青岛、北京等地成立区域中心，是一家专业从事基因科技及健康服务的国家高新技术企业。锐翌生物依托高通量测序技术平台，专注于人体微生物组前沿技术和研究成果在基础科研领域的突破，以及在医学上的转化应用，助力高等院校、医院的科研工作者多角度、全面地探究和解决科学问题，助力更多优质科研成果发表。同时，在大肠癌早筛早诊、感染微生物宏基因组检测等精准医疗领域开发检测技术及应用方案，致力于为医疗机构提供疾病早期检测和健康综合管理服务，目前已和全国医院达成深度合作。
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